Начало работы
Привет сейчас ты за 5 шагов узнаешь, как пользоваться платформой
Секвенирование ДНК и РНК — это рутинный процесс, позволяющий, тем не менее, вникнуть в суть всего живого. Первоначально расшифровка генома была «развлечением» для избранных, а сегодня заказать эту услугу может каждая вторая научно-исследовательская лаборатория. С каждым годом проникнуть в дебри геномной, транскриптомной и эпигеномной информации становится все проще. Этот обзор посвящен основным принципам секвенирования нуклеиновых кислот и может послужить превосходным путеводителем как для любителя, изучающего основы молекулярной биологии, так и для специалиста, который планирует эксперимент и грезит научными прорывами.
Что такое ДНК?
Физически дезоксирибонуклеиновая кислота — это макромолекула, которая хранит в себе наследственную информацию и, по сути, является подробной инструкцией по развитию организма в целом. Она имеет спиральную структуру, которая состоит:
Каждая цепочка включает в себя 4 разновидности нуклеотидов: тимин, аденин, цитозин и гуанин, в которых и происходит запись всей наследственной информации. Причем обе нити закручиваются в спираль не хаотично. Из всех 4 нуклеотидов находиться напротив друг друга в разных цепочках они могут только двумя парами: гуанин-цитозин и аденин-тимин. Эти пары называются комплементарными.
Между парными нуклеотидами возникает устойчивая водородная связь. Причем у аденина-тимина она несколько слабее, чем у гуанина-цитозина. Тем не менее скручивание в спираль позволяет уменьшить длину нити генов вплоть до 6 раз. А в случае со суперспирализацией — до целых 30 раз. Все это подтверждает тот факт, что спиральность как таковая служит для того, чтобы компактнее уложить в клетку всю наследственную информацию.
Хранителями наследственной информации в организме являются клетки ДНК и особое значение имеет порядок нуклеотидов в них. В числе других общеизвестных фактов — форма двойной спирали, которую имеет молекула ДНК.
Эти знания кажутся рядовыми, а ведь не так давно они были недоступны человечеству. Подробное описание молекулы ДНК появилось лишь в 1953 году, а впервые секвенировать геном получилось в 2001 году. Ниже мы чуть подробнее остановимся на истории генетики – раздела биологии, занимающегося изучением генов, генетических вариаций и наследственности в организмах и ее практической пользе.
Впервые , ранее неизвестное вещество, состоящее из фосфора и азота, был выделен в 1869 году швейцарским врачом Иоганном Мишером. А чуть позже, основываясь на его свойствах, он уточнил, что это кислота. К началу ХХ века возникли различные гипотезы о молекуле ДНК, в основе которых лежало представление о ней как о комбинации 4 нуклеиновых кислот. На тот момент не было понимания того, как она используется в организме.
Исследования продолжались, и микробиологи пристально изучали свойства ДНК и РНК. К середине 1940-х годов ДНК рассматривалась как Параллельно ученые пытались определить структуру белков. И первым, кто смог их секвенировать, стал , дважды в истории ставший нобелиатом по химии.
Изучая инсулин, он стал разделять его на отдельные аминокислоты с помощью специальных реагентов. И уже через 8 лет Сенгер смог расшифровать структуру и порядок составных частей инсулина. Открытие было удостоено Нобелевской премии, а сам метод получил имя химика.
Разбирать же РНК и в особенности ДНК оказалось гораздо сложнее. Геном первых бактерий был расшифрован в 1995 году, а прочитать все гены человека получилось лишь в феврале 2001.
Методы секвенирования
Первым способом обработки целых геномов стал так называемый Sanger sequencing. Методика секвенирования по Сенгеру предполагала использование ДНК-полимеразы и радиоактивно меченых нуклеотидов. С течением времени она прошла несколько модификаций, в числе которых «плюс-минус» и «обрыв цепи», и долгое время считался «золотым» стандартом. К категории методов «старого поколения» также стоит отнести и химическую деградацию, предложенную Максамом и Гилбертом, но не получившую распространения по причине быстрого развития энзимологии.
Сегодня уже разработаны и активно развиваются новые технологии для определения последовательности ДНК:
В их основе лежит стремление к автоматизации , увеличению объема получаемых сведений и удешевлению процесса. Появление метода NGS (next generation sequencing) позволило ускорить выявление полной последовательности миллионов геномов, единовременно оценить работу тысяч генов в тканях, организмах и отдельных клетках.
В настоящий момент NGS-метод применяется в рамках анализа:
Генома — анализ всего наследственного материала клетки организма. Дорогостоящая процедура, востребованная в случае, если другие методы оказались неэффективны.
Экзома — секвенирование части генома (1%), отвечающей за синтез белка. До 85 % от всех мутаций, связанных с болезнями, составляют именно поломки в экзоме. Наиболее распространенный тип исследования.
В рамках исследования проводится определение возможных генетических причин различных заболеваний. Наиболее часто применяются в диагностике наследственных эпилепсий, аутизма, обмена веществ, нервно-мышечных и нейродегенеративных заболеваний и др.
Выбери тест
«Выбери тест, предмет и нажми кнопку «Начать решать»
Календарь
На основе статей спецпроекта мы решили сделать календарь «12 методов биологии» на 2019 год. Эта статья представляет апрель.
Молодец!
Ты прошел обучение! Теперь ты знаешь как пользоваться сайтом
и можешь переходить к решению заданий
Что понимают под генетическим секвенированием?
Под подразумевают несколько методов, цель которых — определение нуклеотидной последовательности в ДНК. На данный момент нет ни одного способа, который бы работал для этой макромолекулы целиком. Все они устроены одинаково: сначала ДНК многократно клонируется и рассекается в случайных местах, а затем каждый такой участок читается по-отдельности.
Клонирование выполняется либо выращиванием клеток в чашке Петри, либо при помощи полимеразной цепной реакции. В кратком виде, независимо от метода секвенирования, оно выглядит так:
Все эффекты достигаются за счет изменения температуры смеси из праймеров, ДНК и полимеразы. Процесс отличается точностью и исключает ошибки, при этом на выходе получается множество копий участков одной и той же дезоксирибонуклеиновой кислоты. Прочитать их можно несколькими способами.
Вкладки
После выбора предмета необходимо выбрать на вкладке задания, варианты ЕГЭ, ОГЭ или другого теста, или теорию
Секвенирование по Сэнгеру
Один из наиболее популярных методов секвенирования обязан своим появлением английскому биофизику Фредерику Сэнгеру (1918–2013) — единственному ученому в истории мировой науки, получившему сразу две Нобелевские премии по химии (в 1958 и 1980 годах). Первую премию присудили за установление структур белков, особенно инсулина, а вторую награду ему вручили в том числе и за разработку методов определения первичной последовательности нуклеиновых кислот.
Методику секвенирования ДНК с использованием радиоактивно меченых нуклеотидов и ДНК-полимеразы (или фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I) предложили Сэнгер и его коллеги в 1977 году, причем с течением времени этот метод прошел несколько модификаций и к настоящему моменту считается золотым стандартом современного секвенирования.
Рисунок 4. «Плюс-минус» метод секвенирования ДНК, предложенный Ф. Сэнгером и А. Коулсоном.
Секвенирование ДНК по Сэнгеру
Рисунок 5. Метод «терминаторов»: используют ДНК-полимеразу, олигонуклеотидные праймеры и смесь четырех дезоксинуклеотидов (dNTPs) (А, Т, G и C), один из которых радиоактивно помечен по α-положению фосфата (32P). В каждую из четырех реакций добавляется по одному 2’,3’-дидезоксинуклеозидтрифосфату (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP), которые терминируют дальнейшую реакцию (синтез комплементарной молекулы ДНК с матрицы) — таким образом в каждой пробирке образуется набор фрагментов ДНК разной длины, которые заканчиваются одним и тем же нуклеотидом. Затем полученные фрагменты визуализируют с помощью электрофореза и, сравнивая длины фрагментов из четырех реакций с ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP, восстанавливают последовательность ДНК.
Автоматизированные модификации метода «терминаторов» активно применяют до сих пор в специальных приборах — секвенаторах. Открытие многочисленных флуоресцентных молекул позволило отказаться от использования радиоактивной метки и сделало возможным проведение реакции в одной пробирке. Реакционную смесь разделяют капиллярным электрофорезом, a выстроившиеся в синтезируемую цепочку ДНК меченые нуклеотиды затем регистрируют детекторами флуоресценции, предоставляя возможность считывать последовательность всего секвенируемого ДНК-фрагмента.
Другие методы секвенирования «старого поколения»
Секвенирование по Сэнгеру позволяет «считывать» последовательности до 1000 пар нуклеотидов и применяется для небольших фрагментов генома/генов. В частности, оно используется для:
Наиболее популярными секвенаторами, использующими технологию секвенирования по Сэнгеру, являются приборы, производимые компанией Thermo Fisher Scientific: 3730xL, 3730, 3500xL, 3500, 3130xL, 3130, 310.
Следует отметить, что все описанные выше типы исследований сейчас можно проводить с помощью секвенирования «нового поколения», речь о котором пойдет в следующей главе, однако главные плюсы секвенирования по Сэнгеру — высокая точность (достоверность) полученных данных и невысокая стоимость работ при анализе небольшого количества ДНК-фрагментов — сохраняют актуальность этого типа определения последовательности НК.
Пора зарегистрироваться!
Так твой прогресс будет сохраняться.
Появление и развитие технологий секвенирования
С момента открытия нуклеиновых кислот прошло уже почти полторы сотни лет. В далеком 1869 году Иоганн Фридрих Мишер выделил из находившихся в гное клеток неизвестное доселе вещество, содержащее азот и фосфор, которое назвал нуклеином, а затем (из-за его свойств) — нуклеиновой кислотой. Первоначально считалось, что молекулы нуклеиновых кислот — резерв фосфора в клетках, однако уже в первой половине XX века ученые доказали их наследственную природу. Тогда же появилось понятие гена —наименьшей структурной и функциональной единицы наследственности, — и сформировалась новая наука — генетика.
Вплоть до середины прошлого века структура носителей генетической информации и способы ее передачи оставались неясными. Модель двойной спирали ДНК, которая входит во все современные учебники генетики и молекулярной биологии, предложили в 1953 году Френсис Крик и Джеймс Уотсон (за это в 1962 ученые получили Нобелевскую премию). Последовавшие следом открытие генетического кода и разработка центральной догмы молекулярной биологии дали мощный толчок к развитию естественных наук, в первую очередь — генетики. Основные исторические вехи этого процесса показаны на рисунке 1.
Рисунок 1. История геномных исследований и секвенирования нуклеиновых кислот. 8 марта 1865 г. — Грегор Мендель доложил результаты своих опытов, объясняющие механизм наследования. 1869 г. — Иоганн Фридрих Мишер выделил из клеток в гное неизвестное доселе вещество, содержащее азот и фосфор, которое назвал нуклеином. 1905–1909 гг. — появление терминов «ген» и «генетика». 1953 г. — Френсис Крик и Джеймс Уотсон предложили структуру двойной спирали ДНК. 1958 г. — Френсис Крик сформулировал центральную догму молекулярной биологии. 1975 г. — Сэнгер с коллегами разработал «плюс-минус» метод секвенирования ДНК. 1977 г. — группа Сэнгера разработала метод «терминаторов». 1977 г. — Максам и Гилберт предложили метод секвенирования ДНК путем химической деградации. 2001 г. — опубликован первый полный геном человека. 2005 г. — коммерциализация технологии пиросеквенирования. 2006 г. — коммерциализация технологии Solexa (Illumina). 2006 г. — коммерциализация технологии лигазного секвенирования. 2010 г. — коммерциализация технологии ионного полупроводникового секвенирования (технология PostLightTM). 2011 г. — первый коммерческий релиз секвенаторов PacBio, основанных на технологии одномолекулярного SMRT-секвенирования. 2015 г. — начало продаж первых приборов, основанных на секвенировании через нанопору. Чтобы увидеть рисунок в полном размере, нажмите на него.
Рисунок 2. Секвенирование нуклеиновых кислот (другими словами, определение их нуклеотидной последовательности) — это расшифровка первичной структуры линейных молекул ДНК или РНК, состоящих из последовательности «букв» — нуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ и УТФ. Эти «буквы» зачастую именуют просто по азотистому основанию, входящему в их состав — аденин (А), гуанин (Г), цитозин (Ц), тимин (Т), а также урацил (У) в случае РНК.
Расшифровка и аннотация (маркировка генов и других объектов в последовательности ДНК) генома человека поставили вопрос об использовании генетической информации как для диагностики заболеваний и их долговременного прогнозирования у человека, так и для исследования популяционной структуры сообществ, этногенеза и эволюционных процессов. Применение современных технологий секвенирования и генотипирования предлагает перспективные способы решения задач современной медицинской геномики и эпигеномики.
Такие результаты могут быть использованы при создании систем для проведения дифференциальной диагностики и выявления генетической природы заболеваний, для проведения персональной терапии и подбора методик лечения на основе анализа индивидуальных генетических характеристик. Решение таких задач тесно связано с разработкой эффективных алгоритмов и математических моделей для биоинформатической обработки данных геномного секвенирования и их использованием на базе суперкомпьютерных кластеров.
Рисунок 3. Современные технологии делают процесс секвенирования ДНК рутинной процедурой.
Технологической основой для подобных исследовательских и сугубо прикладных проектов служат геномные секвенаторы (приборы, на которых проводят секвенирование), поставляемые различными коммерческими компаниями, такими как Illumina, Thermo Fisher Scientific, Oxford Nanopore Technologies, Pacific Biosciences и другие.
В 2017 году на рынке представлены сразу несколько перспективных разработок в области секвенирования НК. Эти подходы применены в секвенаторах нового поколения:
Однако наибольший интерес представляет не сама последовательность генома, а понимание того, как он функционирует: какие гены обеспечивают жизнедеятельность клетки, как происходит регуляция (включение или выключение генов) или какие генные пути начинают работать в ответ на стрессовые факторы.
Все современные секвенирующие платформы отличаются от метода секвенирования по Сэнгеру тем, что не требуют этапа клонирования фрагментов ДНК. Это экономит рабочее время и позволяет избежать ряда проблем с клонированием АТ-богатых участков. Общий принцип пробоподготовки для большинства современных (NGS) секвенаторов включает фрагментирование ДНК, привязку к субстрату, амплификацию фрагментов с помощью ПЦР (в одномолекулярном секвенировании от ПЦР удалось отказаться) и последующее считывании последовательности НК. В отличие от метода секвенирования по Сэнгеру, современные платформы обеспечивают параллельное проведение миллиардов реакций в малых объемах, что позволяет получить намного больший объем информации на выходе.
Рассмотрим основные технологии секвенирования нуклеиновых кислот подробнее.
Отметки
Отмечай те статьи, что прочитал, чтобы было удобнее ориентироваться в оглавлении
Применение
В первую очередь, секвенирование может служить надежным инструментом для выявления причин наследственных патологий. Анализ универсальный и позволяет наряду с генами или их участками читать и митохондриальную ДНК.
Кроме того, метод может использоваться при планировании семьи в качестве скрининга на носительство патогенных мутаций в одном и том же гене у родителей, что ведет к рождению ребенка с рецессивным заболеванием. Полногеномное и полноэкзомное секвенирование также позволяет получить сведения о мутациях в генах, связанных с развитием рака яичников или молочной железы.
Глубина анализа генома выше, чем у таких масштабных современных исследований, как, к примеру, экзомное секвенирование, ввиду охвата всей последовательности ДНК. Но отличия в клинической эффективности от того же экзома не в разы, а на несколько процентов. Поэтому в большей степени сегодня выбор типа исследования осуществляется на усмотрение врача, а также пациента, который хочет получить максимум информации на будущее.
Секвенирование ДНК нового поколения (Next Generation Sequencing) на современном оборудовании в короткие сроки.
Список используемой литературы
Сбоку ты можешь посмотреть статистику и прогресс по предмету
Определение последовательности нуклеотидов в днк ( секвенирование )
Для
определения последовательности
нуклеотидов в ДНК было создано несколько
методов. Во всех этих методах ферменты
рестрикции используются
для фиксации специфических «точек
отсчета». Последовательность
нуклеотидов определяют в одноцепочечных
фрагментах, состоящих из
100-200 нуклеотидов. Более длинные
последовательности составляются из
коротких фрагментов с частично
перекрывающимися концами. При
секвенировании комплементарной цепи
проверяется правильность описания
последовательности нуклеотидов в первой
цепи.
Все
методы определения последовательности
нуклеотидов основаны на
создании исходного набора одноцепочечных
фрагментов ДНК, начинающихся
в определенной точке и оканчивающихся
определенным нуклеотидом,
тогда как размеры фрагментов могут быть
различны. Каждый
такой исходный набор фрагментов затем
фракционируют по размерам посредством
электрофореза в геле. Фрагменты должны
быть помечены
радиоактивным изотопом, для того чтобы
их размер можно было определять
путем радиоавтографии геля. Принципы
секвенирования изображены
схематически на рис. 9.8.
274Организация
и передача генетического материала
9.
Методы работы с ДНК275
Секвенирование «нового поколения» — next-generation sequencing (NGS)
За последние полтора десятилетия были разработаны, коммерциализированы и продолжают успешно развиваться совершенно новые технологии определения последовательности НК, в основе которых лежит стремление к миниатюризации, автоматизации, увеличению объема получаемых данных, а также удешевлению процесса. Появление NGS впервые позволило значительно ускорить и удешевить определение полной последовательности миллионов геномов организмов, начиная от бактерий и заканчивая человеком. Более того, появилась реальная возможность единовременно оценивать экспрессию (работу) тысяч генов в организмах, тканях и единичных клетках (секвенирование транскриптомов), а также анализировать регуляцию их активности (анализ экспрессии микроРНК и метилирования генома). В настоящее время на рынке представлено сразу несколько разработок, позволяющих определять последовательность полных геномов организмов, проводить анализ экспрессии генов и метилирования генома. Эти подходы реализуются на секвенаторах нового поколения производства коммерческих компаний Illumina, Thermo Fisher Scientific, Pacific Biosciences и Oxford Nanopore Technologies. Часть разработанных платформ уже ушли с рынка (например, GS FLX, 454/Roche или HeliScope/Helicos Bioscience); другие, пройдя несколько реинкарнаций и модификаций, прочно закрепились на нем (Illumina и Thermo Fisher Scientific); третьи только нащупывают почву, намереваясь занять свою нишу и найти своего потребителя (например, Oxford Nanopore Technologies).
Появление высокопроизводительных технологий секвенирования сопровождается прогрессом программного обеспечения — создаются алгоритмы с открытым программным кодом, появляются открытые источники данных и платформы для вычислений. Новые математические и информационные технологии позволяют геномике развиваться быстрее и использовать более сложные алгоритмы. Эти алгоритмы могут включать в себя сразу несколько приложений и программ и позволяют работать с очень большим объемом данных.
Секвенирование «нового поколения» применяется как для анализа геномов организмов, для которых уже доступен референсный геном (ресеквенирование), так и для того, чтобы впервые расшифровать геном организма (секвенирование de novo).
Для ресеквенирования успешно используют платформы, генерирующие большое количество коротких чтений (секвенируемых фрагментов ДНК), поскольку даже относительно короткие фрагменты ДНК успешно картируются (картирование, или выравнивание, — процесс биоинформатического поиска расположения конкретного короткого фрагмента в полной геномной последовательности) на референсный геном (последовательность ДНК в цифровом виде, составленную учеными как общий репрезентативный пример последовательности генома конкретного вида) при биоинформатическом анализе данных. Такие выравненные чтения могут использоваться для поиска однонуклеотидных полиморфизмов (SNPs), малых делеций и инсерций или других структурных изменений в геноме.
Что касается секвенирования de novo и сборки новых, ранее не прочитанных, геномов, то использование коротких чтений сильно усложняет сборку, особенно в случае больших по размеру и сложно устроенных геномов эукариот (например, полиплоидных геномов). В этих случаях используют комбинированный подход — сочетание платформ, генерирующих как короткие, так и длинные чтения. При сборке генома de novo ученые уподобляются ребенку, пытаясь правильно сложить элементы геномного пазла (короткие фрагменты отсеквенированной ДНК) в единую картину, созданную эволюцией за сотни миллионов лет (рис. 6).
Рисунок 6. Cеквенирование de novo и сборка новых, ранее непрочитанных, геномов требует значительных усилий.
Оценка уровня метилирования генома, например, позволяет определить, какие генные пути и сети включаются в ответ на меняющиеся факторы окружающей среды; такие работы зачастую проводят для изучения эволюционных механизмов в живых системах. Изучение экспрессии кодирующих белки и некодирующих РНК в разных тканях и клетках также позволяет понять и описать гены, вовлеченные в жизнедеятельность клеток, органов и организмов.
Пиросеквенирование
Одним из первых методов глубокого секвенирования, предложенным на суд научного сообщества, было пиросеквенирование, подразумевающее «секвенирование путем синтеза». Основной смысл этого типа секвенирования заключается в последовательном синтезе ДНК на ДНК-фрагментах изучаемого организма в специальных пиколитровых «реакторах». В ходе синтеза дочерней цепочки ДНК детектируют пирофосфаты, высвобождающиеся при включении нуклеотида в синтезируемую на матрице (участке молекулы ДНК, служащим матрицей для синтеза) комплементарную цепь .
Готовые ДНК-библиотеки иммобилизуют на магнитных сферах. Затем магнитные сферы с нанесенной на них клональной библиотекой доставляют на проточную ячейку, где в присутствии праймера, дезоксинуклеотидтрифосфатов и ферментов — ДНК-полимеразы, люциферазы, АТФ-сульфурилазы — происходит циклический синтез новой цепи.
Во время цикла пиросеквенирования при образовании фосфодиэфирной связи между матричной цепочкой ДНК и нуклеотидом синтезируемой цепи выделяется пирофосфат, который запускает каскад химических реакций, приводящих к выделению АТФ, необходимой для реакции окисления люциферина с выделением кванта света, который фиксируют аналоговой интегральной микросхемой (ПЗС-матрицей), состоящей из светочувствительных фотодиодов. Нуклеотиды, не вовлеченные в синтез новой цепи, удаляют из проточной ячейки, и начинается следующий реакционный цикл, в ходе которого добавляют дезоксинуклеотидтрифосфат другого типа (рис. 7).
Рисунок 7. Принцип пиросеквенирования. При включении нуклеотида в синтезируемую цепочку ДНК происходит регистрация высвобождающихся пирофосфатов — побочного продукта реакции полимеризации нуклеотидов в ДНК.
Технология секвенирования на молекулярных кластерах с использованием флуоресцентно меченых нуклеотидов
Суть метода заключается в следующем. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры, необходимые для ПЦР и последующего секвенирования на молекулярных кластерах. Полученные ДНК-библиотеки иммобилизуют на поверхности проточной ячейки, где и проводят циклический процесс секвенирования. Реакционная смесь для синтеза комплементарной ДНК подается на поверхность проточной ячейки и содержит ферменты, олигонуклеотиды, а также четыре типа флуоресцентно меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов. После включения в синтезируемую цепь ДНК нуклеотида-терминатора идентифицируют с помощью ПЗС-матрицы как тип включенного нуклеотида, так и его положение. Затем терминирующая группа и флуоресцентная краска отщепляются от нуклеотида, и цикл синтеза повторяется. Эта серия шагов продолжается определенное количество раз, число которых задает пользователь (рис. 8).
Рисунок 8. Принцип секвенирования на молекулярных кластерах: полимеризация (синтез «дочерней» цепочки) ДНК с использованием флуоресцентно меченых нуклеотидов внутри специальной камеры, регистрирующей флуоресценцию.
Размер чтений, получаемых с секвенатора, может достигать 300 п.о. (прибор Illumina MiSeq). Кроме того, серия секвенаторов 2017 года NovaSeq позволяет определять последовательность до 48 геномов человека за один запуск прибора.
Технология циклического лигазного секвенирования
Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК размером 25–75 п.о. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры, необходимые для эПЦР на магнитных сферах и последующего секвенирования на проточной ячейке.
Магнитные сферы с нанесенной на них клональной библиотекой помещают на проточную ячейку, где и происходит секвенирование с помощью лигирования восьминуклеотидных зондов, несущих четыре различных флуорофора на 5’-конце. Флуоресценция считывается с помощью специальной камеры после каждого цикла секвенирования и, затем переводится в последовательность нуклеотидов (рис. 9).
Рисунок 9. Принцип лигазного секвенирования и последовательность зондов, которые используют при секвенировании. Зонды для секвенирования можно разделить на несколько участков (начиная с 3’-конца): первые два нуклеотида зонда лигируются к комплементарным участкам на секвенируемой ДНК-библиотеке, нуклеотиды с третьего по пятый — вырожденные (т.е. могут гибридизоваться с любыми тремя нуклеотидами секвенируемой ДНК-библиотеки). Нуклеотиды с шестого по восьмой также способны гибридизоваться с любыми тремя нуклеотидами секвенируемой ДНК-библиотеки, однако они отщепляются вместе с флуоресцентным красителем в конце каждого цикла секвенирования.
Ионное полупроводниковое секвенирование
Ионное полупроводниковое секвенирование, основанное на технологии PostLightTM, разработано компанией Ion Torrent и в настоящее время применяется в приборах, реализуемых Thermo Fisher Scientific — Ion S5 / Ion S5 XL, Ion Proton, Ion Personal Genome Machine (PGM).
Технология, предлагаемая в этой приборной линейке, основана на использовании полупроводниковых микрочипов для секвенирования. Суть этого подхода весьма проста и заключается в регистрации локального изменения рН на микрочипе в момент удлинения синтезируемой цепи ДНК-полимеразой на ДНК-матрице (рис. 10).
Рисунок 10. Принцип полупроводникового секвенирования основан на обнаружении ионов водорода, которые выделяются во время полимеризации ДНК.
Пробоподготовка (приготовление ДНК-библиотек) напоминает таковую при циклическом лигазном секвенировании. Первоначально ДНК фрагментируют, затем к концам полученных фрагментов лигируют специфические ДНК-адаптеры, необходимые для эмульсионной ПЦР на магнитных сферах и последующего секвенирования.
Одномолекулярное секвенирование
Создание платформы Pacific Biosciences не только решило проблему ПЦР-дупликатов, но и значительно увеличило длину чтений, что крайне важно при сборке геномов de novo. Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК размером до 20 000 п.о. с лигированными к их концам специфическими ДНК-адаптерами, необходимыми для последующего секвенирования.
Рисунок 11. Принцип нанопорового секвенирования, коммерциализованный компанией Oxford Nanopore Technologies. Данный тип секвенирования основан на измерении меняющейся силы тока при прохождении молекулы НК сквозь нанопору в двухслойной мембране.
Суть работы нанопоровых систем (MinION, GridION X5, PromethION и SmidgION), предложенных британской компанией, достаточно проста. Реакционная камера, в которой проходит процесс считывания последовательности НК, разделена двухслойной мембраной с единичной порой. К камере прикладывается напряжение, вызывающее движение ионов и молекул ДНК или РНК через пору. При прохождении молекулы НК сечение поры (доступное для миграции ионов) уменьшается, в результате чего сила тока падает. Таким образом, считывая изменение силы тока, можно определять тип нуклеотида, проходящего через пору в конкретный отрезок времени.
Кроме описанных выше двух технологий компания Helicos Biosсiences пыталась продвинуть на биотехнологический рынок свою технологию одномолекулярного секвенирования — true Single Molecule Sequencing (tSMS). Данный подход во многом схож с технологией секвенирования на молекулярных кластерах (Illumina), однако позволяет обходиться без ПЦР при пробоподготовке.
Суть метода заключается в определении нуклеотидной последовательности фрагментов геномной ДНК размером до 50 п.о. К обоим концам предварительно фрагментированной ДНК лигируют адаптеры. Полученные ДНК-библиотеки иммобилизуют на поверхности проточной ячейки, где и проводят циклический процесс секвенирования. Один цикл состоит из удлинения синтезируемой на матрице цепочки за счет одного из четырех флуоресцентно меченых нуклеотидов, присоединение которого детектируется прибором.
Задания
Решай задания и записывай ответы. После 1-ой попытки
ты сможешь посмотреть решение
12 биологических методов в картинках
Генеральный партнер цикла — компания «Диаэм»: крупнейший поставщик оборудования, реагентов и расходных материалов для биологических исследований и производств.
Партнер этой статьи — «СкайДжин»
Пять причин выбрать SkyGen:
Одна из главных миссий «Биомолекулы» — докопаться до самых корней. Мы не просто рассказываем, какие новые факты обнаружили исследователи — мы говорим о том, как они их обнаружили, стараемся объяснить принципы биологических методик. Как вытащить ген из одного организма и вставить в другой? Как проследить в огромной клетке за судьбой нескольких крошечных молекул? Как возбудить одну крохотную группу нейронов в огромном мозге?
И вот мы решили рассказать о лабораторных методах более системно, собрать воедино в одной рубрике самые главные, самые современные биологические методики. Чтоб было интереснее и нагляднее, мы густо проиллюстрировали статьи и даже кое-где добавили анимации. Мы хотим, чтобы статьи новой рубрики были интересны и понятны даже случайному прохожему. И с другой стороны — чтобы они были так подробны, что даже профессионал мог бы обнаружить в них что-то новое. Мы собрали методики в 12 больших групп и собираемся сделать на их основе биометодический календарь. Ждите обновлений!
Использование секвенирования нового поколения
Производительность и относительная доступность NGS-методов привели к настоящей революции в биологической и медицинской науке. Более того, благодаря новым подходам появилась реальная возможность проводить ранее технически недоступные исследования. Использование секвенирования нового поколения позволяет проводить такие проекты как:
Решение задачи по цитологии
Формат ответа: цифра или несколько цифр, слово или несколько слов. Вопросы на соответствие “буква” – “цифра” должны записываться как несколько цифр. Между словами и цифрами не должно быть пробелов или других знаков.
Известно, что все виды РНК синтезируются на ДНК-матрице. Фрагмент молекулы ДНК, на которой синтезируется участок центральной петли тРНК, имеет следующую последовательность нуклеотидов: ЦТТАЦГГГЦАТГГЦТ. Установите нуклеотидную последовательность участка тРНК, который синтезируется на данном фрагменте, и аминокислоту, которую будет переносить эта тРНК в процессе биосинтеза белка, если третий триплет соответствует антикодону тРНК. Ответ поясните. Для решения задания используйте таблицу генетического кода.
Правила пользования таблицей:
Первый нуклеотид в триплете берётся из левого вертикального ряда, второй — из верхнего горизонтального ряда и третий — из правого вертикального. Там, где пересекутся линии, идущие от всех трёх нуклеотидов, и находится искомая аминокислота.
Фрагмент цепи ДНК имеет последовательность нуклеотидов: ГТГТАТГГААГТ. Определите последовательность нуклеотидов на иРНК, антикодоны соответствующих тРНК и последовательность аминокислот в фрагменте молекулы белка, используя таблицу генетического кода.
В биосинтезе полипептида участвуют молекулы тРНК с антикодонами УАЦ, УУУ, ГЦЦ, ЦАА в данной последовательности. Определите соответствующую последовательность нуклеотидов на иРНК, ДНК и последовательность аминокислот во фрагменте молекулы белка, используя таблицу генетического кода.
Известно, что все виды РНК синтезируются на ДНК-матрице. Фрагмент цепи ДНК, на которой синтезируется участок центральной петли тРНК, имеет следующую последовательность нуклеотидов: ТГЦЦЦАТТЦГТТАЦГ. Установите нуклеотидную последовательность участка тРНК, который синтезируется на данном фрагменте, и аминокислоту, которую будет переносить эта тРНК в процессе биосинтеза белка, если третий триплет соответствует антикодону тРНК. Ответ поясните. Для решения задания используйте таблицу генетического кода.
Участок молекулы ДНК имеет следующий состав: — Г-А-Т-Г-А-А-Т-А-Г-Т-Г-Ц-Т-Т-Ц. Перечислите не менее 3 последствий, к которым может привести случайная замена седьмого нуклеотида тимина на цитозин (Ц).
Заключение
В наши дни происходит бурное развитие технологий, связанных с исследованием генов, белков и других молекулярных структур живых организмов. Разрабатываются портативные, быстрые, точные и универсальные методы исследований биологических объектов. Появление высокопроизводительных технологий секвенирования НК сопровождается развитием в области программного обеспечения, создаются алгоритмы с открытым программным кодом. Новые математические и информационные технологии позволяют геномике развиваться быстрее и использовать более сложные алгоритмы (например, нейронные сети).
Нажми, чтобы начать решать вариант. Как только ты перейдешь
на страницу, запустится счетчик времени, поэтому подготовь заранее все, что может тебе понадобиться